細(xì)胞分離:
外周血用電動助吸器按照每管不多于35ml,平均分至50ml離心管中,931×g,離心8min,吸取上層血漿至50ml離心管中,取1.5ml于EP管中,標(biāo)記,-80℃保存。用NA稀釋血細(xì)胞,使得血細(xì)胞:NA為1:1,混勻后均勻緩慢地加至相應(yīng)的A液上層,形成完整的界面。596×g,離心20min??梢娒黠@分層。吸棄第1層上清,小心輕柔地將第2層的白色細(xì)胞層分別吸至不同的潔凈50ml離心管中。分別向各管中加NA,稀釋混勻,定容至40ml/管。931×g,離心8min。吸棄上清,加NA重懸細(xì)胞。凍存處理前留取細(xì)胞懸液計數(shù)和活力測定。液氮罐
細(xì)胞冷凍保存
純化后細(xì)胞重懸于含終濃度9.8%的等體積DMSO2ml和右旋糖苷的冷凍保存液中,冷凍保護(hù)液配置成2組(1組含80%的無血清培養(yǎng)液,另1組含80%自體血漿)輕輕混勻后置-20℃冰箱冷卻平衡5-15min到4℃以下,同時把凍存管放4℃冰箱平衡15min。分裝入2ml凍存管內(nèi),每管1ml,管壁做好標(biāo)識。放在樣本凍存盒,轉(zhuǎn)移至程序降溫盒儀器,最終將細(xì)胞保存于-196℃液氮內(nèi)。液氮罐