胚胎干細胞從囊胚內(nèi)細胞團分離得到,具有自我更新和分化為3個胚層和生殖細胞的潛能。豬胚胎分離培養(yǎng)體系會改變細胞核移植胚胎、孤雌胚胎和體內(nèi)胚胎多能基因的表達,也會影響豬多能干細胞形成的效率和質(zhì)量。
自增壓液氮罐
細胞培養(yǎng):用于核移植供體的豬胎兒成纖維細胞從初生豬仔的耳部分離得到。細胞培養(yǎng)基為DMEM,15%胎牛血清,培養(yǎng)溫度為37℃。使用0.25%(W/V)的胰蛋白酶消化,中和后離心200×g。將細胞重懸后并加入等量凍存液(40%DMEM,40%FBS和20%DMSO),貯存在液氮中。
卵母細胞的收集和準備:從屠宰場收集豬卵巢,保存在含有青/鏈霉素的生理鹽水中,運輸溫度32~38℃,3h內(nèi)運回實驗室。采用抽吸法采集卵巢卵母細胞。抽取3~6mm卵泡中的卵母細胞置于15mL離心管中,37℃水浴靜置數(shù)分鐘,待卵母細胞沉降后,用洗卵液洗2遍,顯微鏡下挑取顆粒細胞層達3層以上的卵丘卵母細胞復合物,然后將COCs轉入U型皿中培養(yǎng)42~44h,每孔加500μL成熟培養(yǎng)液,每孔放置50~70枚。
孤雌激活和胚胎培養(yǎng):用電融合儀將成熟的卵母細胞進行電激活,將卵母細胞移至2mmol/L6D孵育2.5h。分別將卵母細胞轉移到胚胎培養(yǎng)基G1、NCSU23和豬受精卵培養(yǎng)基,24h后記錄卵裂率。3d后,將培養(yǎng)基G1中發(fā)育的胚胎移入囊胚培養(yǎng)基G2。再次培養(yǎng)3~4d后,統(tǒng)計囊胚個數(shù)并收集。
體細胞核移植胚胎培養(yǎng):去除成熟卵母細胞第一極體,隨后注入供體細胞。顯微操作后,移入含10%FBS的M199培養(yǎng)基,在38.5℃,5%CO2條件下孵育0.5h,使用電融合儀進行激活處理,移入6D孵育2.5h后,將重組胚胎在NCSU23培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d,隨后替換NC-SU23繼續(xù)培養(yǎng)3~5d,觀察胚胎的發(fā)育。
體內(nèi)胚胎的收集:從人工受精的母豬體內(nèi)收集第7~8d的囊胚,所有方法參照Stokes等。每天監(jiān)測母豬的發(fā),將發(fā)日期作為0d,鑒定后的6、12和18h進行人工受精。從子宮沖洗胚胎時使用預熱的含10%FBS的磷酸緩沖鹽溶液。
從豬胚胎分離胚胎多能干細胞:將去除透明帶的囊胚接種到絲裂 素C處理過的小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層上2~4d,囊胚內(nèi)細胞團在3~5d后出現(xiàn)。待ICM大小適中時,用機械法分離細胞,重鋪到新的飼養(yǎng)層上,并使用不同的豬胚胎干細胞培養(yǎng)基,胚胎多能干細胞克隆每5~7d使用機械法傳代。
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