氣相液氮罐超低溫保藏菌種操作方法
液氮超低溫菌種保藏技術(shù)是將菌種保藏在-196℃的液態(tài)氮,或在-150℃的氣相液氮罐的氮?dú)庵械拈L期保藏方法,它的原理是利用微生物在-130℃以下新陳代謝趨于停止而有效地保藏微生物。
操作步驟如下:
1.安瓿管或凍存管的準(zhǔn)備
用圓底硼硅玻璃制品的安瓿管,或螺旋口的塑料凍存管。注意玻璃管不能有裂紋。將凍存管或安瓿管清洗干凈,121℃下高壓滅菌15~20分鐘,備用。
2.保護(hù)劑的準(zhǔn)備
保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護(hù)劑時(shí),應(yīng)注意其濃度,一般采用10~20%甘油。
3.微生物保藏物的準(zhǔn)備
微生物不同的生理狀態(tài)對存活率有影響,一般使用靜止期或成熟期培養(yǎng)物。
分裝時(shí)注意應(yīng)在無菌條件下操作。
菌種的準(zhǔn)備可采用下列幾種方法:
刮取培養(yǎng)物斜面上的孢子或菌體,與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi);
接種液體培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)后取菌懸液與保護(hù)劑混合分裝于凍存管內(nèi);
將培養(yǎng)物在平皿培養(yǎng),形成菌落后,用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊(直徑約5~10毫米),真菌最好取菌落邊緣的菌塊,與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi);
在小安瓿管中裝1.2~2毫升的瓊脂培養(yǎng)基,接種菌種,培養(yǎng)2~10天后,加入保護(hù)劑,待保藏。
4.預(yù)凍
預(yù)凍時(shí)一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1℃為好、使樣品凍結(jié)到-35℃。
目前常用的有三種控溫方法:
程序控溫降溫法,應(yīng)用電子計(jì)算機(jī)程序控制降溫裝置,可以穩(wěn)定連續(xù)降溫,能很好地控制降溫速率。
分段降溫法:將菌體在不同溫級的冰箱或液氮罐口分段降溫冷卻,或懸掛于冰的氣霧中逐漸降溫。一般采用二步控溫,將安瓿管或塑料小管,先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小時(shí),然后取出放入氣相液氮罐中快速冷凍。這樣冷凍速率大約每分鐘下降1-1.5℃。
對耐低溫的微生物、可以直接放入氣相液氮罐或液相液氮罐中。
5.保藏
將安瓿管或塑料凍存管置于氣相液氮罐中保藏。一般氣相中溫度為-150℃,液相中溫度為-196℃。
6.復(fù)蘇方法
從氣相液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管,應(yīng)立即放置在38℃~40℃水浴中快速復(fù)蘇并適當(dāng)搖動。直到內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止,一般約需50秒~100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管,將內(nèi)容物移至適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。
試劑:
都是常用的試劑,一般正規(guī)生化試劑代理公司都有,質(zhì)量上沒有大的問題。