細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于*下196℃液氮中低溫保存,可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來,這樣在需要的時(shí)候再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞,可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種,起到了細(xì)胞保種的作用。
除此之外,還可以利用細(xì)胞凍存的形式來購買、寄贈(zèng)、交換和運(yùn)送某些細(xì)胞。細(xì)胞凍存時(shí)向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑——終濃度5%~15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO),可使溶液冰點(diǎn)降低,加之在緩慢凍結(jié)條件下,細(xì)胞內(nèi)水分透出,減少了冰晶形成,從而避免細(xì)胞損傷。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度開始為-1到-2℃/min,當(dāng)溫度低于-25℃時(shí)可加速,到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)(-196℃)。 目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜(DMSO)和甘油,它們對(duì)細(xì)胞無毒性,分子量小,溶解度大,易穿透細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)材料 儀器:液氮罐、凍存管(塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶)、離心管、吸管、離心機(jī)等。 試劑:0.25%胰酶、培養(yǎng)基、含保護(hù)劑的培養(yǎng)基(即凍存液) 附:凍存液配制:培養(yǎng)基加入甘油或DSMO,使其終濃度達(dá)5-20%。保護(hù)劑的種類和用量視不同細(xì)胞而不同。配好后4℃下保存。
實(shí)驗(yàn)步驟
1、消化細(xì)胞,將細(xì)胞懸液收集至離心管中。
2、1000rpm離心10分鐘,棄上清液。
3、沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng),計(jì)數(shù),調(diào)整至5×106/ml左右。
4、將懸液分至凍存管中,每管1ml。
5、將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口,封口一定要嚴(yán),否則復(fù)蘇時(shí)易出現(xiàn)爆裂。
6、貼上標(biāo)簽,寫明細(xì)胞種類,凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩。
7、按下列順序降溫:室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→低溫冰箱(-30℃1小時(shí))→氣態(tài)氮(30分鐘)→液氮。
注意:操作時(shí)應(yīng)小心,以免液氮凍傷。液氮定期檢查,隨時(shí)補(bǔ)充,絕對(duì)不能揮發(fā)干凈,一般30立升的液氮能用1~1.5月。