1、容器的選擇:使用帶螺旋蓋的2ml塑料安培瓶。
液氮罐
2、檢查安培瓶是否滲漏:用0.05%的亞甲基藍(lán)水溶液在4℃浸泡30-45分鐘,沖洗干凈,棄去含有藍(lán)色染料的安培瓶,其余的安培瓶備用。
3、打印標(biāo)簽(激光打?。?。
4、容器的滅菌:先用蒸餾水漂洗干凈安培瓶,再用蒸餾水在滅菌鍋中121℃浸泡滅菌15分鐘,干燥并將打印好的標(biāo)簽放入安培瓶中,略擰緊螺旋蓋,再行121℃滅菌30分鐘。
5、保藏菌菌齡:處于最大生長(zhǎng)量階段或?qū)?shù)生長(zhǎng)期后期。
6、保護(hù)劑:選用5-10%的甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑。
1)甘油的準(zhǔn)備:在121℃滅菌15分鐘,2-8℃貯存。甘油一般以兩倍最終所需濃度的水溶液保存,然后與同等量的細(xì)胞懸液混合。若不用細(xì)胞懸液,則以最終所需濃度的水溶液保存。
2)二甲基亞砜:用0.22um的聚四氟乙烯過(guò)濾膜過(guò)濾除菌。過(guò)濾膜預(yù)先用甲醇和二甲基亞砜漂洗。無(wú)菌的二甲基亞砜以10-15ml裝量2-8℃避光保存。
7、分裝:在無(wú)菌條件下,將細(xì)胞懸液(從平板上打下直徑為5cm的菌塊)分裝于安培瓶中,并注入保護(hù)劑,擰緊螺旋蓋。
8、將安培瓶固定在鋁夾上,貼好標(biāo)簽。為了便于取用,一般一個(gè)鋁夾上僅放一個(gè)菌株。
9、將控溫系統(tǒng)先預(yù)冷到4℃,再將鋁夾放入其中。以每分鐘1℃降溫至-40℃,然后以每分鐘10℃降溫至-90℃。降溫以后,將鋁夾轉(zhuǎn)移至處于液氮中的儲(chǔ)存器中保存。
10、菌種的復(fù)活:將液氮保藏的菌種取出,迅速放入37℃水浴中解凍。一般需2至2.5分鐘,等完全解凍后,再及時(shí)轉(zhuǎn)接到合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
液氮罐