本實驗觀察了大鼠胎腦組織在液氮中保存的細(xì)胞存活率,并用保存的組織和新鮮組織做同種異體移植實驗。
液氮罐廠家
一、實驗方法
正常妊娠15~21天的SD大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后,在無菌條件下剖腹取胎,切取所需胎腦組織,制成1mm大小的組織塊。用吸管將其移入含10%二甲基亞砜(DMSO)的無血清DMEM培養(yǎng)液中,裝進(jìn)凍存管,于4℃平衡1小時后置入-30℃冰箱。約1小時后標(biāo)本溫度降至-30℃(降溫速率為0.5℃~1.0℃/分),然后放入液氮中保存。需要時,取出凍存管于37℃水浴中復(fù)溫,冰塊熔化后再用Hank液以1∶1比例對凍存液反復(fù)稀釋4次,每次3分鐘。此時即可用于檢測和移植。細(xì)胞存活率檢測先采用胰酶消化制成細(xì)胞懸液,用0.4%臺盼藍(lán)染色1分鐘,再按血球計數(shù)方法對死活細(xì)胞分別計數(shù),求出細(xì)胞存活率。腦內(nèi)組織移植分A、B兩組進(jìn)行,每組12只,分別進(jìn)行新鮮組織移植和保存組織移植。兩種組織均取自胎鼠頂葉,前者離開母體時間不超過20分鐘,后者在液氮中保存30天。采用左頂葉皮層切開移植,每次植入3~5塊組織。飼養(yǎng)6~8周后處殺,取腦,連續(xù)石蠟切片,進(jìn)行HE、Nissl和嗜銀染色。
二、結(jié)果
細(xì)胞存活率觀察:不同部位組織在液氮中保存10天和30天,細(xì)胞存活率(%)大腦組織為67.78±4.46和65.14±4.55,小腦組織為68.93±5.67,腦干組織為71.07±7.43和69.63±1.99。經(jīng)方差分析,三種組織之間細(xì)胞存活率差別不顯著(P>0.05),不同保存時間之間細(xì)胞存活率差別也不顯著(P>0.05)。
腦內(nèi)移植組織學(xué)觀察:A組移植物成活例數(shù)7/12,移植物位于皮層下或伸入側(cè)腦室,體積較大,周邊有薄層膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)帶。移植物內(nèi)是均勻分布的大型神經(jīng)元和少量散在的膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)元核大,染色淡,核仁清楚,并可見到雙核仁細(xì)胞,胞漿中尼氏小體豐富。移植物內(nèi)有新生血管結(jié)構(gòu)及比較致密的神經(jīng)纖維網(wǎng),在交界面上也有少量神經(jīng)纖維。B組移植物成活例數(shù)2/10(2例感染不計),移植物位于皮層下,體積小,呈散在的細(xì)胞團(tuán)樣,神經(jīng)元核大淡染,胞漿不豐富。移植物內(nèi)也可見到血管內(nèi)皮細(xì)胞,嗜銀染色見移植物中神經(jīng)纖維稀少。
液氮罐廠家
三、討論
本實驗考察了兩步法梯度降溫液氮保存胎腦組織的可能性。此法保存大鼠胎腦組織10天和30天平均細(xì)胞存活率在60%~70%。將新鮮的和保存30天的組織植入同種大鼠腦內(nèi),組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)兩組都有移植物成活,但是與新鮮組織移植相比,保存的組織移植后移植物體積小,神經(jīng)元數(shù)量少,胞漿不豐富,移植物內(nèi)神經(jīng)纖維少見,表明神經(jīng)元分化較差。結(jié)果提示,用兩步法梯度降溫液氮保存胎腦組織可取得較高的細(xì)胞存活率,移植后也有一定的成活率,但是移植物成活質(zhì)量明顯不如新鮮組織移植。所以,這種保存方法能否實際應(yīng)用還值得討論和進(jìn)一步研究。