液氮罐凍存樣品的方法 :(以獨(dú)立樣品pc12為例)
1、選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。一般長(zhǎng)約為70%-80%即可凍存,細(xì)胞數(shù)目過(guò)少或過(guò)多都不宜凍存,因?yàn)閺?fù)蘇后細(xì)胞生存率會(huì)降低;收集細(xì)胞24小時(shí)前換液一次。
2、用培養(yǎng)液直接將細(xì)胞消化下來(lái),離心,1000轉(zhuǎn), 5min;
3、吸去上清,在離心管中加入凍存液,(凍存液配制按照60%已過(guò)濾的培養(yǎng)基 + 10%DMSO+ 10%胎牛血清+20%馬血清配置凍存液(其中DMSO要自己配置), 4度保存?zhèn)溆谩?,加入凍存液后吹散計(jì)數(shù),控制細(xì)胞懸液密度為5*106或1*107左右(不過(guò)有人建議其實(shí)不必要細(xì)胞計(jì)數(shù),根據(jù)細(xì)胞的多少,估計(jì)一下一瓶細(xì)胞凍存幾支就行了,細(xì)胞密度高一點(diǎn)比較好,操作時(shí)間短,對(duì)細(xì)胞損傷小。), 細(xì)胞懸液以1ml的量分裝入凍存管中(每個(gè)凍存管添加不超過(guò)1-1.5m),在凍存管上標(biāo)記凍存日期,姓名以及細(xì)胞種類(lèi)。最好選擇進(jìn)口的凍存管;
4、要嚴(yán)密封口,慢凍過(guò)程(1.先將凍存管放入4℃冰箱,約1H。 2.接著置于-20℃冰箱,約40min-1h。 3.置于-80超低溫冰箱中放置過(guò)夜。 4.置于液氮罐中長(zhǎng)期保存。) , 注意將凍存管豎立于合適大小的不銹鋼飯盒中,應(yīng)避免凍存管倒立。
液氮罐凍存樣品的注意事項(xiàng):
1、使用DMSO前,不需要進(jìn)行高壓滅菌,它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會(huì)破華它的分子結(jié)構(gòu),以至于降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下,DMSO對(duì)人體有害,故在配制時(shí)最好戴上手套操作。最好使用前將DMSO4度凍一下,對(duì)細(xì)胞的毒性會(huì)減少。
2、不宜將凍存細(xì)胞放置在0℃~-60℃這一溫度范圍內(nèi)過(guò)久,低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi),是“危險(xiǎn)溫區(qū)”。
3、注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量,及時(shí)添加。
4、多余的凍存液可以4度保存?zhèn)溆谩?/p>