細(xì)胞凍存是細(xì)胞生存的重要要領(lǐng)之一,使用凍存技能將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫生存,可以使細(xì)胞臨時(shí)離開(kāi)生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性生存起來(lái),如許在必要的時(shí)間再蘇醒細(xì)胞用于實(shí)行。并且適度地生存肯定量的細(xì)胞,可以防備因正在造就的細(xì)胞被污染或其他不測(cè)變亂而使細(xì)胞丟種,起到了細(xì)胞保種的作用。
液氮罐
除此之外,還可以使用細(xì)胞凍存的情勢(shì)來(lái)購(gòu)置、寄贈(zèng)、互換和運(yùn)送某些細(xì)胞。 細(xì)胞凍存時(shí)向造就基中參加掩護(hù)劑——終濃度5%~15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO),可使溶液冰點(diǎn)低落,加之在遲鈍凍結(jié)條件下,細(xì)胞內(nèi)水分透出,淘汰了冰晶形成,從而制止細(xì)胞毀傷。尺度冷凍速率開(kāi)始為-1 到 -2℃/min,當(dāng)溫度低于-25℃時(shí)可加快,到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)(-196℃)。
現(xiàn)在常用的掩護(hù)劑為二甲亞砜(DMSO)和甘油,它們對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性,分子量小,溶解度大,易穿透細(xì)胞。
使用材料
儀器:液氮罐、凍存管(塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶)、離心管、吸管、離心機(jī)等
試劑:0.25%胰酶、造就基、含掩護(hù)劑的造就基(即凍存液)
附:凍存液配制:造就基參加甘油或DSMO,使其終濃度達(dá)5-20%。掩護(hù)劑的種類和用量視差別細(xì)胞而差別。配好后4℃下生存。
操作步聚
1.消化細(xì)胞,將細(xì)胞懸液網(wǎng)絡(luò)至離心管中。
2.1000rpm離心10分鐘,棄上清液。
3.沉淀加含掩護(hù)液的造就,計(jì)數(shù),調(diào)解至5106/ml左右。
4.將懸液分至凍存管中,每管1ml。
5.將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口,封口肯定要嚴(yán),不然蘇醒時(shí)易出現(xiàn)爆裂。
6.貼上標(biāo)簽,寫(xiě)明細(xì)胞種類,凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩。
7.按下列次序降溫:室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→低溫冰箱(-30℃ 1小時(shí))→氣態(tài)氮(30分鐘)→液氮。
液氮罐
注意:操縱時(shí)應(yīng)警惕,以免液氮凍傷。液氮定期查抄,隨時(shí)增補(bǔ),絕對(duì)不克不及揮發(fā)潔凈,一樣通常30立升的液氮能用1~1.5月。