種質(zhì)資源設(shè)施保存,是在人工控制環(huán)境下排除環(huán)境壓力和破壞,有效保存種質(zhì)材料的最安全的保存方式,它包括種子低溫保存、超低溫保存、種質(zhì)離體培養(yǎng)保存等技術(shù)方法。
下面,液氮罐技術(shù)人員就來詳細(xì)說一下種質(zhì)液氮超低溫保存技術(shù)。
自增壓液氮罐
目前正在深入研究的超低溫保存方法,是長期貯藏種質(zhì)的保存方法之一。這種方法是將種質(zhì)材料(包括種子、組織體等)保存在-196℃的液氮環(huán)境中,以達到更長期的保持生命力或活力的目的。在液氮(-196℃)溫度下,細(xì)胞的生長和代謝完全停止,能安全穩(wěn)定、節(jié)省空間、長期有效地建立起離體基因庫,超低溫保存是長期貯存植物種質(zhì)的最有效方法,甚至被認(rèn)為是實現(xiàn)生物種質(zhì)永久保存的唯一途徑。
種質(zhì)超低溫保存方法包括將保存材料變溫處理到-196℃條件下,并安全保存;在需要時將超低溫保存種質(zhì)的材料變溫到常溫條件下并恢復(fù)活力(或生命力)等一整套生物技術(shù)。
一般來說,它包括以下6個步驟:
(1)前培養(yǎng):對培養(yǎng)體短期的生長鍛煉處理,使其提高耐液氮保存的能力。
(2)防凍:培養(yǎng)體放入防凍液中,使其細(xì)胞降低冰點,減少因形成冰晶可能造成的損傷。
(3)變溫冷凍:按照不同變溫模式降溫冷凍,降溫速度依不同種質(zhì)材料采用特定的速度。
(4)超低溫保存:將冷凍材料保存到有效低溫環(huán)境中,以防止冰的游移或解體。
(5)解凍:一般認(rèn)為快速解凍更好。從液氮環(huán)境中取出封裝好的材料,與其容器一同放入+40℃的無菌水浴中,直到解凍后才回到室溫下,未封裝的材料放到20~30℃的液體培養(yǎng)基中解凍。
(6)生命力測定:如用TTC染色法等。
種質(zhì)材料的超低溫保存,傳統(tǒng)的技術(shù)有干凍法、預(yù)凍法和兩步法,上世紀(jì)80年代末和90個代初玻璃化法和包埋脫水法開始應(yīng)用于植物材料的超低溫保存。
干凍法:利用無菌空氣流、干燥硅膠或飽和溶液表面的氣相等對種質(zhì)材料進行脫水處理,然后快速將其投入液氮貯存。
預(yù)凍法:將種質(zhì)材料在添加保護劑(如蔗糖、二甲亞砜、甘油等)后置于低溫冰箱或液氮蒸汽箱(-10~-70℃)中冰凍若干小時后投入液氮貯存。
自增壓液氮罐
兩步法:種質(zhì)材料在添加保護劑后,用程序降溫儀以某個速率(每分鐘0.1~0.5℃)降溫至轉(zhuǎn)移溫度(-40~-70℃),然后投入液氮中貯存,兩步法較預(yù)凍法更為嚴(yán)格。
玻璃化法:種質(zhì)材料用高濃度的復(fù)合冰凍保護劑處理后,快速投入液氮貯存,細(xì)胞直接用極高濃度的保護劑脫水,在快速降溫時胞內(nèi)胞外都進入玻璃化態(tài),而不形成冰晶,從而避免了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞。包埋脫水法:莖尖、分生組織和體細(xì)胞胚等種質(zhì)材料用褐藻酸鈣包埋后,第一階段先在含高濃度蔗糖的培養(yǎng)基中脫水,第二階段用無菌空氣流或干燥硅膠脫水,然后投入液氮貯存。
超低溫保存技術(shù)在保存植物花粉、種子和胚、芽、莖尖、愈傷組織和懸浮細(xì)胞等方面有應(yīng)用和報道,目前主要應(yīng)用在作物、果樹和園林花卉種質(zhì)資源保存方面,林木種質(zhì)資源的超低溫保存也有少量報道。