研究表明,不同材料采用超低溫冷凍法脫毒時冷凍降溫方法直接關(guān)系到成苗率,選擇合適的冷凍方法對脫毒成功與否至關(guān)重要。不同冷凍降溫方法各有優(yōu)缺點,根據(jù)材料特性選擇適合的方法。目前常用的冷凍方法有:快速降溫法、慢速冷凍法、逐級冷凍法、干燥冷凍法、玻璃化冷凍法、包埋玻璃化法等。直接將預(yù)培養(yǎng)材料投入液氮中的快速降溫法具有操作簡單、不需要特殊設(shè)備的優(yōu)點,但是對含水量高的愈傷組織其成活率為零,不適用該方法。
液氮罐廠家
將材料從0℃逐漸降到-100℃,使得其細胞中的含水量逐漸流出到細胞外,細胞中的含水量降到最低程度,然后再從-100℃直接投入液氮中降到-196℃,這樣可以避免水分在細胞中結(jié)冰而破壞細胞,這種慢速冷凍法可以提高成活率。一般細胞在-10℃時細胞外的介質(zhì)基本形成結(jié)晶,而細胞內(nèi)部并未結(jié)冰,這樣形成細胞內(nèi)外的蒸氣壓差,如果使細胞在不同低溫下-20,-50,-70,-100℃下各處理一段時間,使細胞內(nèi)的水溶液在蒸氣壓下向細胞外不斷擴散,脫水后細胞內(nèi)原生質(zhì)逐漸發(fā)生濃縮,其冰點降低,再投入液氮中時就減弱低溫結(jié)冰對細胞造成的傷害,大大提高回復率和成活率,這種逐級冰凍方法在多數(shù)材料超低溫保存中獲得成功。對于含水量較高的愈傷組織,采用將材料進行脫水預(yù)處理,然后迅速投入液氮。這樣細胞經(jīng)過脫水處理后細胞內(nèi)部含水量大大降低,原生質(zhì)的濃度大大提高,提高愈傷組織的冷凍處理后的恢復成活率。用一種保護劑PVS2[其組成為:30%(W/V)甘油+15%(W/V)乙二醇+15%(W/V)DMSO+0.4mol/L蔗糖]對材料進行處理后再迅速投入到液氮中,細胞經(jīng)過保護劑處理后可以避免細胞胞內(nèi)外形成冰晶,而形成玻璃化狀態(tài),這種方法成活率高,但是很容易脫水過度,影響成活率,采取與逐級冷凍法結(jié)合處理來提高恢復率。當材料較多時,可以先采用褐藻酸鈣將材料進行包埋,然后用高蔗糖濃度的培養(yǎng)基脫水預(yù)處理,再用干燥的硅膠進行脫水處理,再迅速投入到液氮中。為了保證成活率,經(jīng)常結(jié)合幾種冷凍降溫方法合并使用。
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