1.卵母細(xì)胞的采集和體外成熟培養(yǎng)(IVM)
從屠宰場(chǎng)收集的新鮮綿羊卵巢,放在滅菌過(guò)并預(yù)熱的37℃、0.9%生理鹽水保溫杯中,送到實(shí)驗(yàn)室。再用同樣生理鹽水清洗卵巢2~3遍,直至干凈。使用抽吸法吸取卵泡液,顯微鏡下篩取顆粒細(xì)胞緊密的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs),放入預(yù)先加熱的采卵液和成熟液各洗3次,放入成熟微滴中,CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23~24h。培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后使用透明質(zhì)酸酶去顆粒細(xì)胞進(jìn)行10~15min的消化。在顯微鏡下挑選形態(tài)完整、胞質(zhì)均勻并排出第一極體的卵母細(xì)胞。
液氮罐價(jià)格
2.卵母細(xì)胞的冷凍保存
BS、VS、ES預(yù)先在室溫下平衡20min左右,再把處理好的細(xì)胞放入BS中稍微洗滌后就移入ES中停留5~10min,經(jīng)過(guò)皺縮又復(fù)張到原先大小的80%為止,再移入VS后一并吸入冷凍管中,投入液氮罐中進(jìn)行冷凍保存。
3.解凍
將1.0mol/L蔗糖溶液37℃預(yù)熱20min,再將1.0、0.5、0.25mol/L蔗糖溶液和BS分別放入預(yù)熱的4孔皿中,室溫下平衡20min。將冷凍細(xì)胞分別在上述梯度蔗糖溶液中分別放置3min,最后轉(zhuǎn)入BS中,緩慢升溫5min,即可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。
4.免疫組化
用預(yù)熱的生理鹽水清洗卵巢后放入4%多聚甲醛中,4℃固定24h,然后移入30%蔗糖溶液中脫水,脫水至卵巢在自然狀態(tài)下下沉至底部即可。將處理好的卵巢放入冷凍切片機(jī)里冷凍30min,用O.C.T.包埋。切片厚度為10μM的卵巢放在防脫載玻片上放進(jìn)PBS溶液中4℃過(guò)夜。用0.1%TritonX-100里通透30min,用PBS在脫色搖床上搖洗3次,每次10min。然后放入CD9一抗Anti-CD9Antibody(1:100)(陰性對(duì)照加PBS代替一抗)中4℃過(guò)夜。經(jīng)一抗孵育的切片用PBS搖洗3次,每次10min后室溫?fù)u床孵育二抗GoAtAnti-rAbbitI9GH&L(1:200)孵育1~2h,再用PBS搖洗3次,每次10min。DAPI室溫孵育5min,PBS搖洗3次,最后滴加抗熒光淬滅劑,即可熒光顯微鏡觀察。
液氮罐價(jià)格
5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR
(1)綿羊卵母細(xì)胞總RNA的提取 RNA提取依據(jù)微量樣品總RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。卵母細(xì)胞的收集同1.2.1、1.2.2和1.2.3步驟,各收集300個(gè)新鮮GV期、MⅡ期卵母細(xì)胞和冷凍GV期、MⅡ期卵母細(xì)胞,離心去上清加入350μL終濃度1%裂解液,再加5μL的4ng/μLCArrierNA工作液,勻漿,加入1倍體積70%乙醇,再將所有液體移入吸附柱crⅠ上放進(jìn)離心管里,12000r/min離心1min,棄廢液。加350μL去蛋白液,12000r/min離心1min,棄廢液。管中加80μL配制好得dnAsEⅠ工作液,室溫放置15min加350μL去蛋白液,12000r/min離心1min,棄廢液。再加500μL漂洗液,室溫放置2min,12000r/min離心1min,棄廢液。12000r/min離心2min,棄廢液,置于室溫?cái)?shù)分鐘以徹底曬干殘余漂洗液。將吸附柱crⅠ放入新的離心管中,加入14μLrNAse-freeddh20,室溫放置2min,13000r/min離心2min,所得溶液為RNA溶液。用酶標(biāo)儀測(cè)定RNA的D260nm/D280nm值。
(2)總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 按照Pri-mESCriptTMrTMAsterMix(PerfectreAl-time)試劑盒說(shuō)明書,PCR反應(yīng)總體系為20μL:5×Prime-ScriptTMrTMAsterMix4μL,rNA5.5μL,rNAse-freeddh2O10.5μL。輕輕混勻,37℃15min,85℃5s,溫度降到4℃終止反應(yīng),-80℃保存。
(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 利用SYBr PreMixExTAqTMⅡ檢測(cè)綿羊卵母細(xì)胞CD9基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1
[基因引物序列.jpg]
PCR擴(kuò)增體系20μL:SYBR(PreMixExTAqTMⅡ(2×)10μL,ROXReferenceDye(50×)0.4μL,上、下游引物(10μMoL/L)各0.5μL,RNAse-free ddH2O7.6μL,cdnA1μL。每個(gè)樣品做3個(gè)技術(shù)重復(fù)和3個(gè)平行試驗(yàn)。PCR反應(yīng)程序:95℃30s;95℃30s,61℃30s,72℃20s;95℃1Min,55℃30s;95℃30s。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)所得ct值計(jì)算CD9mRNA的相對(duì)表達(dá)量,采用sAs軟件中GLM進(jìn)行方差分析,并使用鄧肯氏多重比較,P<0.05為差異顯著。
6.Western blotting分析 卵母細(xì)胞的蛋白提取采用了細(xì)胞總蛋白提取的方法。同1、2和3步驟收集新鮮GV期、MⅡ期卵母細(xì)胞和冷凍GV期、MⅡ期卵母細(xì)胞各500個(gè),10000R/Min離心2Min,棄上清液。震蕩至細(xì)胞沉淀完全擴(kuò)散。加28μLRiPA裂解液,用超聲波破碎儀破碎數(shù)秒后再加2μLPMSF蛋白酶抑制劑和2μLβ-巰基乙醇,整個(gè)過(guò)程均在冰上進(jìn)行,最后加8μLSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)充分混合后,95℃變性5Min。配制5%濃縮膠和12%分離膠,進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。在20MA電流、20MV恒壓的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,取出PVdF膜后放入封閉液中,室溫?fù)u床1~2h,以便去掉膜上的非特異性蛋白,提高目的蛋白與抗體的特異性結(jié)合。分別放入Anti-CD9Antibody(1:1000)和MsMAbtobEtAActin(1:2000)中,4℃過(guò)夜。取出與一抗孵育的膜,用洗膜液搖洗3次,每次10Min。再分別與CD9二抗donKEyAnti-RAbbitiGGh&L(hRP)(1:2000)和β-Actin二抗GoAtAnti-MousEiGG(h&L)hRPconJuGAtEd(1:2000)在室溫?fù)u床孵育1~2h,洗滌3次,每次10Min,dAb染色,觀察結(jié)果。