豬胚胎干細胞分離培養(yǎng)自我更新和分化潛能,利用不同培養(yǎng)條件,從孤雌胚胎、細胞核移植胚胎和體內(nèi)受精胚胎中分離樣細胞。
液氮容器
1.細胞培養(yǎng)用于核移植供體的豬胎兒成纖維細胞
從初生豬仔的耳部分離得到。細胞培養(yǎng)基為DMEM,15%胎牛血清,培養(yǎng)溫度為37℃,5%CO2。細胞凍存,使用0.25%(W/V)的胰蛋白酶消化,中和后離心200Xg,5min。將細胞重懸后并加入等量凍存液(40%DMEM,40%FBS和20%DMSO),貯存在液氮中。
2.卵母細胞的收集和準(zhǔn)備
從屠宰場收集豬卵巢,保存在含有青/鏈霉素的生理鹽水中,運輸溫度32~38℃,3h內(nèi)運回實驗室。采用抽吸法采集卵巢卵母細胞。抽取3~6mm卵泡中的卵母細胞置于15mL離心管中,37℃水浴靜置數(shù)分鐘,待卵母細胞沉降后,用洗卵液洗2遍,顯微鏡下挑取顆粒細胞層達3層以上的卵丘卵母細胞復(fù)合物(cumulusoocytecomplex,COCs),然后將COCs轉(zhuǎn)入U型皿中培養(yǎng)42~44h,每孔加500µL成熟培養(yǎng)液,每孔放置50~70枚。
3.孤雌激活和胚胎培養(yǎng)
用電融合儀將成熟的卵母細胞進行電激活,漂洗后,將卵母細胞移至2mmol/L6D孵育2.5h。分別將卵母細胞轉(zhuǎn)移到胚胎培養(yǎng)基G1、NCSU23和豬受精卵培養(yǎng)基,24h后記錄卵裂率。3d后,將培養(yǎng)基G1中發(fā)育的胚胎移入囊胚培養(yǎng)基G2。再次培養(yǎng)3~4d后,統(tǒng)計囊胚個數(shù)并收集。
4.體細胞核移植胚胎培養(yǎng)
去除成熟卵母細胞第一極體,隨后注入供體細胞。顯微操作后,移入含10%FBS的M199培養(yǎng)基,在38.5℃,5%CO2條件下孵育0.5h,使用電融合儀進行激活處理,移入6D孵育2.5h后,將重組胚胎在NCSU23培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d,隨后替換NC-SU23繼續(xù)培養(yǎng)3~5d,觀察胚胎的發(fā)育。
5.體內(nèi)胚胎的收集
從人工受精的母豬體內(nèi)收集第7~8d的囊胚,所有方法參照Stokes等(2005)。每天監(jiān)測母豬的發(fā)情,將發(fā)情日期作為0d,鑒定發(fā)情后的6、12和18h進行人工受精。從子宮沖洗胚胎時使用預(yù)熱的含10%FBS的磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffersa-line,PBS)。
6.從豬胚胎分離胚胎多能干細胞
將去除透明帶的囊胚接種到絲裂霉素C(mi-tomycin-C)處理過的小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonicfibroblastcells,MEFs)飼養(yǎng)層上2~4d,囊胚內(nèi)細胞團(innercellmass,ICM)在3~5d后出現(xiàn)。待ICM大小適中時,用機械法分離細胞,重鋪到新的飼養(yǎng)層上,并使用不同的豬胚胎干細胞(por-cineembryonicstemcells,pESCs)培養(yǎng)基(ESM1~ESM6,表1),胚胎多能干細胞克隆每5~7d使用機械法傳代。
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7.免疫熒光檢測
使用4%多聚甲醛固定胚胎10min,PBS洗2次后,加入0.25%Triton-X室溫30min,PBS洗3次,1%BSA室溫封閉1h,4℃孵育一抗24h(1∶200,CDX2;1∶200NANOG)。PBS沖洗3次,孵育熒光標(biāo)記的二抗(1∶1000)室溫1h。PBS沖洗2次后,DAPI染色2min,PBS沖洗2次后在熒光顯微鏡下觀察照相。
8.qRT-PCR
使用0.5%鏈霉蛋白酶A去除豬胚胎的透明帶后,立刻加入5μL的裂解緩沖液(5mmol/L二硫蘇糖醇,1%NP-40,1U/uLRNA酶抑制劑),冰上孵育30min。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將裂解液反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR體系:cDNA2μL,SYBRgreenmix12.5μL,上下游引物各0.3µmol/L0.5μL,ddH2O補充到25μL。反應(yīng)程序:95℃30s;95℃5s,60℃30s,共40個循環(huán)。